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宏基因组测序mNGS在新型冠状病毒检测中的应用

发布日期:2022-11-03 浏览次数:1835

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此次新型肺炎疫情监测和防控中,病原宏基因组测序(mNGS)发挥了至关重要的作用,利用其技术优势,研究人员在5天内就鉴定分析出新型冠状病毒的基因组,而2003年SARS的鉴定耗时5月余、2013年H7N9的鉴定耗时1月余


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2020年2月5日,武汉大学病毒学国家重点实验室、武汉大学中南医院、华中科技大学同济医学院附属同济医院和中山大学医学院的联合研究结果,发表在《Emerging Microbes & Infections》(IF = 6.212)杂志上,题目为《RNA based mNGS approach identifies a novel human coronavirus from two individual pneumonia cases in 2019 Wuhan outbreak》。文章中通过mNGS技术在2例肺炎病例中检测出2019新型冠状病毒(2019-nCoV)。事情始于2019年12月底,临床上发现2例肺部病毒感染病例,但常规抗病毒和抗感染效果不佳,后病情加重。于是采集了患者呼吸道和血液样本进行常规呼吸道病原体临床实验室检测,包括流感病毒、呼吸道合胞体病毒、腺病毒、偏肺病毒、支原体肺炎、衣原体肺炎、军团菌等,均为阴性。其余RNA样本进行SARS-CoV特异性RT-PCR检测,有一组实验结果为阳性。对相应的PCR产物进一步测序发现患者病原体的病毒可能是冠状病毒,但不是SARS-CoV。于是,从肺泡灌洗液(BALF)样本中提取的总RNA进行宏基因组新一代测序(mNGS)文库构建和测序。采用Illumina Miseq平台对文库进行150 bp双端测序。对测序结果分析发现,检测到的病毒reads中大部分与冠状病毒相关(样本1和样本2分别为99.9%和99.7%),另外在样本2中检测到嗜二氧化碳噬细胞菌和韦荣氏球菌,但这两种细菌的致病性尚未清楚。利用Megahit对reads进行从头组装,形成一个30 kb的与CoV具有序列同源的contigs。经过序列匹配确认,最终的CoV基因组为29881 nt。通过序列同源性分析,表明该病毒与此前已知的可以感染人类的冠状病毒存在较大差异,且通过对病毒的基因序列进行进化溯源分析,成功锁定蝙蝠为病毒的自然宿主,但直接宿主还有待进一步确定。后又进行了基因组比对和进化分析,mNGS结果显示,除少量SNP外,患者1和2共识基因组序列相同,表明两个患者在不同时间感染了同一冠状病毒。此项研究中,mNGS在疫情爆发的早期协助研究人员确定了感染原因为一种新型冠状病毒。

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2020年2月11号,中国医学科学院北京协和医学院病原生物学研究所、中日友好医院国家呼吸系统疾病临床研究中心呼吸内科、北京协和医学院中国医学科学院呼吸医学研究所、武汉市疾病预防控制中心、武汉市金银潭医院等单位联合的研究成果发表在《Chinese Medical Journal》杂志上,题目为《Identification of a novel coronavirus causing severe pneumonia in human a descriptive study》。此研究中,研究者收集了湖北省武汉市金银潭医院5例重症肺炎患者的临床资料和支气管肺泡灌洗液样本,提取样本中的RNA后也进行了mNGS检测分析。结果显示5例标本中均发现了一个前所未知、与SARS 病毒核苷酸序列相似度79%、与蝙蝠来源毒株最接近、但形成单独进化分支的新的冠状病毒β属毒株序列。基于基因序列信息,研究者们继续开展病毒分离,并进行形态确认和血清学检测,最终确认了该冠状病毒为新型冠状病毒(2019-nCoV)

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2020年2月13日,国家儿童医学中心(上海)-上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心精准医疗实验诊断中心的研究人员在《中华检验医学杂志》上发表《病原宏基因组测序在新型冠状病毒检测中的应用与挑战》。文章中回顾了mNGS在各类感染病原诊断中的临床应用进展,并探讨其在应用中面临的问题和挑战。文章指出:mNGS是一种基于二代测序技术的无需培养、无偏好性的病原检测技术,可一次性完成细菌、真菌、病毒和寄生虫等多种病原体检测。因此,mNGS为本次疫情感染病原体的进一步确认以及防控争取了时间,也为后续的临床诊断、治疗和药物研发指明了方向。此外,mNGS还可以同时对新型冠状病毒以外的其他病原及混合感染进行综合鉴定。但另一方面,由于mNGS操作复杂、成本较高、检测时间相对较长等原因,在新型冠状病毒的检测上无法实现大范围推广和快速诊断。因此,mNGS可与实时荧光定量PCR(RT-PCR) 技术联合使用,实现优势互补。

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nCoV的起源和进化史(图片来源于文献)

mNGS在此次2019-nCoV疫情监测和防控中发挥了重要作用。除此之外,mNGS在病原微生物检测和鉴定中的应用先前也有报道,例如:2014年新英格兰医学杂志发表 mNGS 确诊钩体病的首例临床应用案例;2018年来自复旦大学附属华山医院的Ai等人报道了感染猪的病原体猪疱疹病毒可跨物种传播,导致人发生眼内炎感染的案例。近年来,mNGS在潜在病原体诊断方面应用的案例逐渐增多,其优势和应用价值也日益凸显。因此,在信息时代,mNGS的临床应用也是病毒诊断的未来趋势。