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肝脏EV转运miRNA调控脂肪组织重塑的机制研究

发布日期:2022-11-02 浏览次数:2297

2020年2月5日,南京大学医学院赵越、方雷、李朝军团队的最新研究发表在国际著名学术期刊《Nature Communications》上(影响因子11.878),题目为《Liver governs adipose remodelling via extracellular vesicles in response to lipid overload》,本文揭示了在营养过剩状态下,肝脏感知机体营养状态,重塑脂肪组织功能,调节机体脂质分布的新机制。
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生命体的代谢稳态依赖于细胞、组织、器官之间的通讯交流,特别是肝脏、脂肪、骨骼肌等代谢器官的相互协同,共同调节生命体对糖脂蛋白质等营养物的利用和储存,以适应外界营养物的供给变化。但是,除了神经内分泌的调控作用外,究竟何种器官起到先导代谢调节作用目前还不清楚。该团队研究发现,肝脏最先感知身体的营养状态,并通过分泌肝源调节因子,特异性调控脂肪组织中脂肪细胞的分化和脂质的积累,协调脂质在身体不同器官的储存和积累。


1. 肝脏最先响应小鼠的急性脂质超载反应

Fig1 a 小鼠的体重。b–c HFD喂养小鼠在不同时间点的肝脏重量(b),iWAT c和eWAT (c)的重量与小鼠整体体重的百分比。d HFD喂养小鼠在不同时间点的肝脏,iWAT和eWAT的HE染色展示。e 肝脏TG含量。f 在指定的时间,HFD喂养小鼠的肝脏中,与脂肪酸运输,脂肪生成和脂肪酸氧化相关基因的表达。g iWAT和eWAT中的TG含量。h–i 在指定的时间,HFD喂养小鼠的iWAT和eWAT中,与脂肪酸运输,脂肪生成和脂肪酸氧化相关基因的表达。 j 在不同时间点,对于HFD喂养小鼠iWAT和eWAT中的脂肪细胞数量进行定量分析。k 在指定的时间,HFD喂养小鼠WATs中,与脂肪形成有关基因的表达。数据源于6周龄C57BL/6J小鼠,喂食HFD持续0h,6h,12h,24h,48h和1周(每组n = 6只小鼠)。iWAT:腹股沟白色脂肪组织。eWAT:附睾白色脂肪组织。 * P <0.05,**P <0.01,*** P <0.001。

2. 脂质超载后,肝细胞通过EVs重塑脂肪细胞
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Fig2 a 将饲喂普通饲料或HFD的小鼠原代肝细胞制备的肝细胞条件培养基(Chow-CM或HFD-CM)在无EV培养基中培养48h,然后将其添加到3T3-L1前脂肪细胞中。MDI诱导第6天,ORO染色检测3T3-L1前脂肪细胞分化的脂肪细胞,然后对3T3-L1前脂肪细胞的ORO阳性染色进行定量分析(n=3个生物学重复样本)。b 用Chow-CM和HFD-CM处理的3T3-L1前脂肪细胞中与脂肪形成相关基因的表达(n=3个生物学独立的样本)。c 对正常饮食喂养的小鼠原代肝细胞EV进行电子显微镜分析。d WB检测EV相关蛋白标记CD63,CD81,TSG101和Syntenin-1。分别进行了三个独立的重复实验,每次实验包含三个样品。e 正常饮食或HFD喂养小鼠的原代肝细胞EV产量(n=6个生物学独立的样本)。f 将肝细胞EV(Chow-EV或HFD-EV)添加到3T3-L1前脂肪细胞中。GW4869(10μM)用于处理供体WT细胞以抑制EV的形成。在MDI诱导后第6天,将3T3-L1脂肪细胞分化的脂肪细胞用ORO染色。g 用10μM GW4869处理原代肝细胞得到的EV产量(n=6个生物学独立的样本)。h 对应图2f的3T3-L1前脂肪细胞中与脂肪生成和脂肪生成相关基因的表达(n=6个生物学独立的样本)。i 将正常饮食或HFD 6h和12周的小鼠肝细胞EV添加到分化8天的3T3-L1前脂肪细胞中。在MDI诱导后第10天,将3T3-L1前脂肪细胞分化的脂肪细胞用ORO染色。j–k 对应图2i中3T3-L1前脂肪细胞中与脂肪形成和脂肪形成有关的基因表达(n=3个生物学独立的样本)。 * P <0.05,**P <0.01,*** P <0.001。

3. 肝脏驱动的脂肪重塑是由肝细胞Ggpps介导
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Fig3 a HFD喂养(12h)C57BL/6J小鼠肝脏和FFA孵育原代肝细胞中Ggpps蛋白水平。FFA混合物包括溶于BSA中的油酸和棕榈酸(2∶1)(每组n=3只小鼠)。b荧光显微镜观察用加扰对照(Scramble)或Ggpps siRNA(siGgpps)处理的原代肝细胞EV。c WT和Ggpps敲减的原代肝细胞EV产量分析(n=6个生物学独立的样本)。d NMR观察正常饮食或HFD喂养的WT和肝脏特异性Ggpps剔除小鼠(LKO)的全身脂肪分布。e 对3d图中小鼠eWAT和iWAT进行质量分析(每组n=6只小鼠)。f 正常饮食或HFD喂养的WT和LKO小鼠中eWAT和iWAT的比较(每组n=6只小鼠)。g 对3f图中小鼠的iWAT和eWAT的脂肪指数分析(脂肪重量相对于全身重量的百分比)(每组n=6只小鼠)。h 对3g图中小鼠iWAT和eWAT进行HE染色。i 正常饮食或HFD喂养的WT和LKO小鼠中iWAT和eWAT的脂肪细胞直径分析。每组数据来源于三只独立的小鼠的HE染色结果,每只小鼠五个视野,每个视野10-15个细胞,并使用ImageJ软件进行分析。j 在HFD喂养的WT和LKO小鼠iWAT中,与脂肪生成和脂解相关的基因表达(每组n=6只小鼠)。数据源于饲喂正常饲料和HFD 12周(从8周龄开始)的WT和LKO小鼠。* P <0.05,**P <0.01,*** P <0.001。

 4. Ggpps通过Rab27A蛋白的香叶酰香叶酰化作用调节肝细胞EV分泌
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Fig4 a WT和肝脏特异性Ggpps敲除小鼠(LKO)喂食正常饲料或HFD后,原代肝细胞EV产量分析(每组n=6只小鼠)。b 正常饮食或HFD喂养的WT和LKO小鼠的亲代细胞和EV中CD63,TSG101和钙连接蛋白的蛋白表达水平。c 通过Triton X-114提取获得膜相关的Rab27A(下面)和细胞质相关的Rab27A(上面)及其免疫印迹分析(n=3个生物学独立的样本)。d 通过TritonX-114提取获得膜相关的Rab5(下面)和细胞质相关的Rab5(上面)及其免疫印迹分析(n=3个生物学独立的样本)。e 用空载体或Ggpps载体与WT或突变型Rab27A共感染原代肝细胞,并用荧光显微镜观察CD63表达。f 来源于图4e中原代肝细胞EV产量分析(n=6个生物学独立的样本)。g 来源于图4e的亲代细胞和EV中TSG101蛋白表达水平分析。数据源于饲喂正常饲料和HFD 12周(从8周龄开始)的WT和LKO小鼠。*P <0.05,** P <0.01,*** P<0.001,WT vs.LKO;### P<0.001,Chow vs. HFD。

5. 肝细胞EV通过Ggpps介导脂肪重塑过程
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Fig5 a 共培养5小时后,3T3-L1脂肪细胞吸收原代肝细胞EV的检测。b 将饲喂普通饲料的野生小鼠原代肝细胞EV通过尾静脉注射到饲喂普通饲料或HFD的WT和LKO小鼠中,空脂质体用作对照,6小时后,使用IVIS Spectrum系统检测肝脏,iWAT和eWAT中的红色荧光水平。c 从普通饲料(Chow-EV)或HFD(HFD-EV)喂养的小鼠中分离原代肝细胞EV,尾静脉注射给正常喂养8周龄的小鼠,每3天进行一次,持续6周,而后对EV处理的小鼠iWAT和eWAT进行比较分析。计算用Chow-EV和HFD-EV处理的iWAT和eWAT重量相对于小鼠全身重量的百分比(每组n=4只小鼠)。d 对应5c图中Chow-EV和HFD-EV处理的小鼠iWAT和eWAT组织中与脂肪生成相关基因的表达分析(每组n =4只小鼠)。e 喂食HFD的WT和LKO小鼠产生的肝EV(分别为HFD-WT EV和HFD-LKOEV)添加到3T3-L1前脂肪细胞中,然后MDI诱导6天,ORO染色检测3T3-L1前脂肪细胞并定量分析ORO染色阳性区域(每组n =3个生物学独立的样本)。喂食HFD的LKO或WT小鼠分离得到原代肝EV(HFD-LKOEV或HFD-WT EV),经尾静脉注射入8周龄的HFD-LKO小鼠中,每3天一次,为期3周。后,比较HFD-LKO小鼠中iWAT和eWAT的质量,及iWAT和eWAT的脂肪指数。空脂质体作对照(每组n=4只小鼠)。g–h 对应5f图小鼠iWAT (g)和eWAT (h)中与脂肪生成和脂解相关基因的表达(每组n=4只小鼠)。数据源于8周龄WT和LKO小鼠。* P <0.05,** P <0.01。

6. 肝细胞EV中miRNA表达分析及其分子机制研究
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Fig6 a 与Chow-EV相比,HFD-EV中若干miRNA的倍数变化。b miRNA敲除的脂肪细胞,接受WT,miR-122-/-,let-7e-5p-/-,miR-31-5p-/-或miR-210-3p-/-原代肝EV后,在脂肪细胞中其对应的miRNA表达下降。c 喂养Chow或HFD的WT小鼠肝细胞EV,及转染了miRNA抑制剂的原代肝细胞EV(Chow-EV,HFD-EV,HFD-EV-WT,HFD-EV-miR-210-3p-/-,HFD-EV-let-7e-5p-/-,HFD-EV-miR-31-5p-/-)添加到3T3-L1前脂肪细胞。MDI诱导后第8天,ORO染色检测3T3-L1前脂肪细胞分化的脂肪细胞。d 对应于6c图的3T3-L1前脂肪细胞中与脂肪分化和脂肪形成相关基因的表达分析。e 喂养HFD的WT或LKO小鼠肝EV及转染miRNAmimics的原代肝细胞EV(HFD-WT EV,HFD-LKO EV,HFD-LKO EV-mimic-NC,HFD-LKO EV-miR-210-3p-mimic,HFD-LKO EV-let-7e-5p-mimic,HFD-LKO EV-miR-31-5p-mimic)分别添加到3T3-L1前脂肪细胞中。在MDI诱导后第8天,将3T3-L1前脂肪细胞分化的脂肪细胞用ORO染色。f 对应于6e图中3T3-L1前脂肪细胞中与脂肪细胞分化和脂肪生成相关基因的表达。g将let-7e-5p(带Cy3标记)转染的原代肝细胞EV(PKH67标记)与3T3-L1前脂肪细胞共同孵育。h 与对照组相比,转染let-7e-5p mimic的原代肝细胞EV与3T3-L1前脂肪细胞共同孵育后,与脂肪酸氧化和产热相关基因表达水平发生不同程度的降低。i 预测let-7e-5p靶向Pgc1α的3'-UTR区及荧光素酶活性实验验证。j Pgc1α表达质粒或空载对照NC、EV-mimic-NC 或EV-let-7e-5p-mimic,共转染3T3-L1细胞,并检测Pgc1α的mRNA和蛋白表达水平。k 腺病毒sh-Pgc1α或对照病毒sh-NC、EV-WT 或 EV-let-7e-5p−/−,共转染3T3-L1细胞,并检测Pgc1α的mRNA和蛋白表达水平。每组n = 3个生物学独立的样品。* P <0.05,**P <0.01;## P <0.01,sh-NC与sh-Pgc1α。
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Fig7 a 23例患者的肝脏TG含量和Ggpps mRNA水平之间的线性回归分析。b–f 与正常饲养组相比,HFD喂养的小鼠血浆EV中,let-7e-5p,miR-210-3p,miR-23b-3p,miR-690和miR-31-5p的表达水平(n= 6只小鼠)。g–j 28例患者血浆EV中的BMI与let-7e-5p,miR-210-3p,miR-31-5p和miR-23b-3p水平之间的线性回归分析。k 患者肝脏中miR-122,let-7e-5p,miR-210-3p和miR-31-5p的相对表达水平。相对值是指,与miR-122表达水平相比,let-7e-5p,miR-210-3p和miR-31-5p表达水平的倍数变化(n=6个样本)。l–o BMI<30或>30的NAFLD患者血浆EV中的Let-7e-5p,miR-210-3p,miR-31-5p和miR-23b-3p的表达水平。相对值是指,与BMI<30的患者EV中miRNA表达水平相比,BMI>30的患者EV中miRNA的倍数变化(BMI<30,n=6个样本;BMI>30,n=10个样本)。* P <0.05,** P <0.01,*** P <0.001,(a,g,h,i,j)线性回归分析; (b,c,d,e,f,l,m,n,o)不成对t检验。

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Fig8 肝脏EV对脂肪重塑的作用机制

该研究发现,高脂食物处理的营养过剩状态下,小鼠肝细胞内的胆固醇合成代谢途径中的香叶基香叶基合成酶GGPPS迅速产生应答,通过影响Rab蛋白的香叶酰香叶酰化,调节细胞外囊泡(EV)的形成和分泌。EV会携带一些信号分子(mRNA、miRNA和蛋白质)靶向作用到较远的组织或细胞中,调节靶细胞的生物学功能。该团队从肝细胞分泌的EV中鉴定出调控脂肪组织功能的miRNA,并明确其通过靶向脂肪细胞脂代谢相关基因如PGC1a,调控脂肪组织的脂质积累。因此,在一定的脂代谢压力下,肝脏不仅仅是一个被动的脂质异位沉积器官,反而能够率先响应不同代谢压力信号,通过产生相应的EV远程调控脂肪组织的功能,协调不同器官的脂质分布,维持生命体的稳态。研究扩大了对肝脏作为代谢节点的认知,为防治肝脏代谢紊乱所致的代谢异常提供了新的诊断依据及药物靶点。