ONCOGENESIS|肠道肿瘤类器官的应用研究

类器官是一项创新性较高的研究技术，近几年来受到科研人士的追捧和广泛好评。目前，我们国家在政策层面也给予了大力地支持。2021年科技部发布的“十四五”国家重点研发计划“干细胞研究与器官修复”重点专项中也特别提到疾病类器官模型。

什么是类器官（Organoids）？

类器官属于三维（3D）细胞培养物，包含其代表器官的一些关键特性。类体外培养系统包括一个自我更新干细胞群，可分化为多个器官特异性的细胞类型，与对应的器官拥有类似的空间组织并能够重现对应器官的部分功能，从而提供一个高度生理相关系统。成体干细胞的组织样本、单一成体干细胞或者通过多能干细胞的定向诱导分化都能够产生类器官。而细胞系异质性差，遗传信息丢失，无法模拟组织器官体内的三维结构；动物模型具有建模周期长，成本高等问题。

类器官的应用前景

2013年，类器官技术被Science誉为十大科技进展，2017年，又被Nature Methods评为生命科学领域的年度技术。类器官技术极具创新性，近年来一直是研究热点，到目前为止已取得多项重大研究领域的突破，但其应用研究目前依然处于起步阶段，其作为一种工具，在广泛的应用研究方面潜力巨大，包括发育生物学、疾病病理学、细胞生物学、再生机制、精准医疗以及药物毒性和药效试验。对于这些应用以及其他应用，类器官培养实现了对现有2D培养方法和动物模型系统的高信息量的互补。此外，通过类器官繁殖的干细胞群取代受损或者患病的组织，类器官提供自体和同种异体细胞疗法的可行性，未来这一技术在再生医学领域也拥有巨大的潜力。

2022 年 1 月 19 日，由诺丁汉大学医学院癌症遗传学和干细胞组Abdolrahman S. Nateri教授团队在ONCOGENESIS(影响因子7.485)发表了最新研究成果，题为《Anti-miR-135/SPOCK1 axis antagonizes the inflfluence ofmetabolism on drug response in intestinal/ colon tumourorganoids》。

图：研究概要和亮点

本研究旨在通过双突变Apc Min Fbxw7 ΔG小鼠结直肠癌 (CRC) 模型的十二指肠息肉和非息肉衍生类器官 (mPO 和 mNPO) 来研究失调miRNA与代谢成分之间的关系。文中分析了mPO 和 mNPO中表达失调的miRNA和代谢相关基因，发现miR-135可能靶向Spock1基因。SPOCK1的上调表达水平与CRC的疾病进展密切相关。敲低CRC患者来源的肿瘤类器官(CRC tPDO)中miR-135b的表达水平，可以降低SPOCK1 表达水平、葡萄糖消耗和乳酸分泌。然而，由miR-135b过表达诱导的SPOCK1增加，则促进Warburg效应，从而促进5-氟尿嘧啶的抗肿瘤作用。因此，与miR-135b反义核苷酸的组合疗法可能代表了一种新的CRC治疗策略。

研究背景

肠道类器官是一种实验模型，它结合了在体外产生整个隐窝上皮细胞多样性，以及生成的生物量相对较快和易于处理的优势。因此，肠道类器官是探索内在上皮细胞缺陷复杂性的绝佳实验平台。至今，只有少数的研究涉及到肠道类器官培养物中代谢物的鉴定。

研究结果

1. 与mNPO相比，mPO中葡萄糖消耗和乳酸产量增加

腺癌是最常见的小肠癌类型，大多数这些肿瘤发生在十二指肠，这是小肠最靠近胃的部分。为了分析小息肉和非息肉部位中的葡萄糖和乳酸代谢谱，研究者构建小鼠十二指肠息肉衍生类器官(mPO)与非息肉衍生类器官(mNPO)模型，通过对其培养基分析发现，与mNPO相比，mPO的葡萄糖消耗率和乳酸生成更高，这表明代谢向无氧糖酵解的转变以维持更高的mPO生长和新的肿瘤细胞的产生。

为了验证上述代谢测定中的结论，研究者采用qPCR分析了12个代谢相关基因的mRNA表达水平，所选基因均参与细胞代谢过程(葡萄糖、活性氧、脂肪酸摄取和组织重塑)。结果表明Aldob、Cyba、HexII、Fabp6、Slc2a5和Spock 1(又名Testican-1，是一种细胞外基质蛋白)、Spock2的表达水平上调，而G6pc、Slc2a1和Slc2a2下调，但是Ephx2和Gstt1在mPO与mNPO中没有变化。蛋白质印迹分析也证实了SPOCK1和SPOCK2蛋白在mPO中被诱导，这与 mRNA水平的表达相一致。其中，SPOCK1 是 TGF-β的正向下游调节因子，其表达通过 Wnt/β-catenin 途径进行调节。除了生理功能外，SPOCK1还是CRC的关键调节因子。

2. 分析mPO与mNPO中癌症相关miRNA的表达差异

为了鉴定息肉肿瘤发展过程的miRNA，采用miRCURY LNA miRNA测定十二指肠 mNPO和mPO之间的miRNA表达谱，使用Exiqon-GenEx-qPCR分析软件对miRNA表达(2^–ΔΔCT) 进行标准化和统计分析。最终，鉴定了几个与癌症相关miRNA，与mNPO相比，在mPO中的表达存在显著差异。其中包括 let-7 家族成员在内的几种 miRNA显著下调，以及13个miRNA在mPO中显著上调表达(>3倍)。

3. miR-135靶向代谢介质细胞外基质糖蛋白SPOCK1

TargetScan Web预测分析发现Spock 1是miR-135的潜在靶标。而且，SPOCK1的表达增加与人结肠腺癌(COAD)的总生存期(OS)差有关。阶段图分析表明，在COAD癌症阶段，SPOCK1的表达逐渐升高，在晚期阶段(StageIII 和StageIV)的表达相对最高。

对预测的miR-135-5p的系统搜索分析显示，超过670个预测基因与细胞代谢(葡萄糖、活性氧、代谢、代谢、脂肪酸摄取和组织微环境)相关。先前的研究也表明，抑制CRC小鼠模型中的miR-135b，可通过控制增殖、侵袭和凋亡相关基因，进而降低肿瘤生长，其可作为检测CRC和晚期腺瘤的无创生物标志物。临床患者衍生的类器官 (PDOs)这代表了一个临床相关的研究平台。接下来，研究团队培养了患者来源的肿瘤类器官(tPDO)和邻近的癌旁来源的类器官(hPDO) 。qRT-PCR 分析发现CRC tPDO 中SPOCK1和miR-135b的表达水平显着高于CRC hPDO。

为了研究miR-135b对SPOCK1表达水平的调节作用，用对照载体慢病毒(Control)或 miRZip-135b(anti-miR-135b)慢病毒转导tPDO，而后验证了抗miR-135b显著降低了CRC tPDO中miR-135b的表达水平。为了确认miR-135b/ SPOCK1轴能够影响tPDO中的代谢反应，对重要的肿瘤代谢物浓度(抗miR-135b处理的类器官培养基中的乳酸和葡萄糖)进行了测定，发现抗miR-135b可减少葡萄糖消耗和乳酸产生。此外，为了确认miR-135b/ SPOCK1转录调控轴，又开展了双荧光素酶报告分析，发现与抗miR-135b共转染显著抑制了含有野生型SPOCK1 3'-UTR-reporter的细胞中荧光素酶活性，而非突变型SPOCK1 3'-UTR-reporter。此外，抑制CRC tPDO中的miR-135b表达后，qRT-PCR检测发现SPOCK1 mRNA水平显著降低，而SPOCK2没有变化。总之，以上结果证明了SPOCK1是miR-135b的靶标基因，用抗miR-135b治疗能够降低SPOCK1的表达。

4. 抑制miRNA-135/ SPOCK1轴使tPDOs细胞对5-FU诱导的细胞抑制作用和细胞毒性敏感

研究团队在tPDO中敲低miR-135b后进行了5-FU(5-氟尿嘧啶)的细胞抑制和形态学测定，发现与miRZip-135b的联合治疗可使tPDOs细胞对5-FU诱导的细胞抑制作用敏感，并加剧了对SPOCK1 基因表达的抑制作用。

此外，通过 SRB 比色法评估了同步/血清饥饿的人APC突变的结肠直肠癌细胞系DLD-1 与正常结肠细胞CCD-841在用10次增加剂量的5-FU±anti-miR-135治疗后的存活率。结果表明，与CCD-841-anti-miR-135细胞(IC50=17.48±1.083)相比，5-FU在DLD-1-anti-miR-135(IC50=10.86±1.135)中表现出更大的细胞毒性。miR-135b敲低(+anti-miR-135) 对结肠癌DLD-1细胞的敏感性高于非癌性(CCD-841) 细胞[DLD-1+anti-miR-135(IC50=5.383±1.188) vs. CCD-841+抗miR-135细胞(IC50= 14.07±1.103)]。选择性指数(SI)的计算方法是将抗miR-135细胞的IC50除以 miR-135b敲低细胞的IC50(DLD-1 SI=2.017 vs. CCD-841 SI=1.242)。SI是一个给出选择性概念的指标，最高值表示更具选择性的候选者。我们的数据与miR-135抑制可影响CRC细胞系对化疗药物耐药性的观察结果一致。

本文小结

本研究创新性地采用肠道类器官模型，研究肿瘤和邻近的非肿瘤类器官(tPOh和tNPO)中具有不同的代谢活性，以及与代谢相关的miRNA表达谱，并确立了miR-135通过靶向SPOCK1从而影响细胞代谢的关键作用，证明了miR-135和SPOCK1协同影响肿瘤细胞的代谢和药物反应。这为CRC的治疗提供了新的思路和理论依据，也为类器官模型在肿瘤药物筛选的研究和应用方面打下了一定程度的基础。