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类器官培养和scRNA-seq技术联合运用,绘制人类发育图谱

发布日期:2021-12-10 浏览次数:405

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类器官(organoids)技术被《Nature Methods》(2017)评为生命科学领域的年度技术。

类器官(organoids)是一种3D(三维)细胞培养系统,与体内来源组织或器官高度相似,它可以复制出已分化组织的复杂空间形态,并能够表现出细胞与细胞、细胞与基质之间的相互作用。理想状态下,类器官与体内分化组织具有相似的生理反应。

相较于传统的2D(二维)细胞培养模型,类器官在物理、分子和生理学等特性上,通常更接近来源组织的特性。因而,在临床研究中,类器官能够比细胞系更能反应人体的真实情况。相较于动物模型,动物水平的测试可以从宏观方面解答一些生物学的问题,但动物系统成本更高、实验周期也更长,动物体内环境更加复杂,也无法聚焦到细胞与细胞之间的相互作用。而类器官能更好地模拟体内环境,也非常便于观察和检测,无疑在动物和细胞水平之间,为遗传发育、疾病研究、药物筛选、再生医学等领域提供了一个更好的研究方案。

单细胞转录组测序(scRNA-seq)技术也是是近年来研究领域中的一项热门检测技术,可以在单个细胞水平上研究遗传信息的差异,分析细胞之间的异质性,鉴定不同的细胞类型及其表现基因,为生物发育学研究提供强大的助力。

本文联合运用了类器官培养技术和单细胞转录组测序技术的优势,利用单细胞测序技术充分分析了多种内胚层衍生器官和不同培养方法构建的类器官的转录图谱,并探究生物发育的奥秘。


文章题目:Charting human development using a multi-endodermal organ atlas and organoid models.

中文题目:采用多种内胚层衍生器官图谱和类器官模型绘制人类发育图谱

研究单位:巴塞尔分子和临床眼科研究所、巴塞尔大学眼科、密歇根大学医学院、苏黎世联邦理工学院、华盛顿大学遗传医学系、密歇根大学工程学院

发表时间:   2021年5月20号

发表杂志:Cell

影响因子:38.637

关键技术:类器官培养,单细胞转录组测序

文章亮点:体外类器官培养为人类发育和疾病研究提供了一种新的功能验证方法和思路。

I. 绘制多种发育中的人内胚层衍生器官的细胞图谱;II. 器官特异性上皮干细胞和间充质细胞特征的鉴定;III. 使用多种器官图谱对肠道类器官的保真度和成熟度进行基准测试;IV. 探究上皮和间充质发育的遗传和培养扰动。


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摘要:器官由多种细胞类型组成,这些细胞类型在器官形成过程中会经历多个瞬时状态。为了探究人类发育过程中的这种多样性,本研究从呼吸道和胃肠道的多个发育中的内胚层衍生器官建立了一个单细胞转录组图谱。阐明了跨谱系的细胞状态、转录因子以及器官特异性上皮干细胞和间充质相互作用。并将多个表达谱作为一个高维搜索空间,在多种培养条件下对人类多能干细胞 (hPSC) 衍生的肠道类器官 (HIO) 进行基准测试。文中指出HIO概括了参考细胞的状态,并使用HIO重建了肠上皮和间充质出现的分子动力学轨迹。本研究表明间充质衍生的干细胞龛因子NRG1可促进体外肠道干细胞成熟,并且同源盒转录因子CDX2是人类肠道上皮和间充质区域化所必需的。这项工作联合运用了细胞图谱和类器官技术以解析人体器官发育是如何协调的。


一. 整合发育中的人类多器官细胞图谱,识别器官特异性特征

作者通过整合来自肺、食道、肝、胃、小肠和肠的新生成以及已发表的单细胞转录组数据(总共155,232个细胞),建立了关于发育的人类多器官参考细胞图谱,并重点关注内胚层衍生器官。聚类分析解析了主要的细胞类型,包括:上皮细胞、间充质细胞、免疫细胞、内皮细胞、神经元和红细胞群,它们可以细分为27个分子不同的簇。其中,上皮细胞和间充质细胞表现出最强的器官特异性。随后,作者鉴定了每个器官的上皮和间质中表达丰富的转录因子(TF)。



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为了解决上皮异质性,作者分别对每个器官进行亚聚类,并根据标记注释细胞类型。作者从每个器官中提取干细胞簇,以确定器官间的异同。根据区域身份评分在伪空间轨迹中对干细胞进行排序,这揭示了器官之间的区别以及肠道从前到后的逐渐过渡。胃肠干细胞标记物LGR5和OLFM4突出强调了器官的特异性,LGR5在整个胃和肠的干细胞群中表达,OLFM4高度富集在小肠干细胞的亚群。然后,作者确定了沿着这条轨迹变化的TFs。许多TFs在组织特异性干性的命运决定或维持中具有何种作用还未被探究过。以上这些数据提供了一个分子谱目录,用于标记发育中的人类内胚层衍生上皮细胞类型。



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图2. 不同器官的上皮细胞异质性和干细胞差异

[左:多个器官的上皮干细胞UMAP,右:LGR5和OLFM4表达的特征]


接下来,分析了发育器官中的神经元和间充质细胞多样性,发现肺相关间充质与胃肠间充质有很大的不同,并确定了表征肺胃肠道身份的TFs和信号分子。然后,分别验证了转录因子NKX2-3和分泌因子WNT2在组织中的表达定位,并将二者作为区分肠和肺间充质的通用标志物。此外,转录因子SALL1特异性标记胃和肠中F3+上皮下间充质(c15,上皮下,NRG1+/ F3 +) ,而转录因子PRRX1用于标记肺中的软骨细胞样、SERPINF1-高表达细胞和周细胞。作者还观察了区分沿胃肠道的间充质细胞种群的特征。


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 图3. 间充质亚型的器官特异性和上皮-间充质信号传导 

[多色荧光原位杂交鉴定胃肠的分子标记物,肠(NKX2-3和SALL1,粉色F3,绿色);和肺(WNT2,粉色)。免疫荧光染色显示平滑肌细胞(SM22蓝色)和上皮 细胞(ECAD,绿色)。虚线定义了上皮细胞-间充质细胞的边界]


随后,作者使用受体-配体配对分析对上皮细胞和间充质细胞群之间的相互作用进行了编目,并确定了许多在特定器官中富集的配对。例如,LGR5-RSPO3受体-配体对在胃、小肠、结肠的上皮干细胞和间充质中富集。多器官的单细胞转录组参考图谱揭示了有关于转录的以及谱系间的信号传递程序的丰富资源,这些程序对于每个器官内的细胞群来说都是特定的,并可能在器官特异性干细胞龛中的间充质-上皮信号传导中起协调作用。


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[热图显示了选定的配体-受体基因对儿的相对交互作用强度]


二. 通过映射多器官参考图谱揭示人类肠道类器官的保真度

接下来,作者试图通过转录图谱来了解肠道类器官的保真度。作者用胚胎干细胞来构建了HIOs,移植到免疫缺陷小鼠的肾囊中,4周和8周时取材并分析细胞异质性。



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图4. hPSC-衍生的肠道类器官 (HIOs) 概括了发育中的小肠特征

[左:HIO 开发示意图;右:移植10 周的HIO(tHIO),比例尺1mm]



移植的HIOs(tHIOs)表现出与人类肠道发育相似的上皮成熟特征,包括:立体型隐窝-绒毛结构的出现、定位于隐窝结构域和分化的分泌谱系(CHGA+肠内分泌,MUC2+杯状细胞)的增殖性(MKI67+)肠干细胞(ISC; LGR5+ / OLFM4+)、沿着绒毛上皮的FABP2+吸收性肠。



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[左上:上皮细胞类型示意图。10周tHIOs中标记物的免疫荧光染色,上皮谱系标记(FABP2、CHGA 和 LCT)、增殖(MKI67)和刷状缘(SI),复染上皮标记EPCAM(绿色)DAPI(蓝色)。右下:tHIOs中干细胞标记基因的RNA原位杂交。比例尺200 μm]



然后,作者对tHIOs进行了scRNA-seq,并观察ISC(C6,LGR5+/OLFM4+),肠上皮细胞前体(C7,FABP2+/APOA4低),肠上皮细胞(C8,FABP2+/APOA4+),肠内分泌细胞(C9,CHGA+/ISL1+)、M细胞(c10、SPIB+/CA7+)和杯状细胞(c11、MUC2+/SPINK4+)。作者检测到其他的上皮簇(c12-c15)缺乏肠道标记基因的表达(如CDX2),反而表达了前肠标记(如MUC5AC、SOX2和FOXJ1)。它们占已测序上皮细胞的34.0%(1082/3182)。作者还鉴定了不同的间充质簇(c1–c5),包括:VSMCs(c5, DES+/RGS5+)和CXCL14+间充质(c4, CXCL14+/NSG1+)。研究人员还注意到SFRP2+间充质 (c2, SFRP2+/PRRX1+) 缺乏肠道标记物NKX2-3的表达,但PRRX1(该基因在发育的肺中高度表达)存在着丰富的表达。这种前肠样脱靶的间充质亚群占已测序tHIO间充质细胞的27.6%(187/678)。

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                  [将tHIOs样品进行scRNA-seq和UMAP分析,按簇(左)或时间点(右上)着色和编号;右下:条形图显示 tHIOs 中肠细胞的上皮细胞类型组成;配色方案同右上]


为了提供对tHIO转录组保真度的定量评估,研究人员计算了每个tHIO细胞与发育中的多器官图谱的距离,并将tHIO细胞映射到参考图谱中。结果发现大约70%的tHIO上皮细胞和间充质细胞被定位到发育中的人类肠道,这些成功定位的部分与基于器官特异性标记的定性评估相类似。值得注意的是,tHIO干细胞定位到肠道,并表达小肠特征,例如:OLFM4、CDX2和PDX1。然后,将tHIO干细胞与胃肠道干细胞伪空间数据进行比较,发现tHIO干细胞与十二指肠干细胞最相似。此外,还发现与新生儿和小儿消化系统障碍相关的基因在tHIO和发育中的十二指肠之间显示出一致的表达模式。tHIO包含多种上皮细胞和间充质细胞,其中大部分以高保真度映射到发育中的小肠上。

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[H左上:tHIO细胞被映射到参考图谱上,按细胞命运进行着色;左下:映射到每个器官的上皮(左)或间充质(右)的 tHIO细胞比例。I右上:箱线图显示每个tHIO簇的CDX2和NKX2-3表达,侧边栏显示细胞命运同H,堆积条形图显示发育中的器官投影概率。J右下:顶部边栏显示每个细胞箱的组织组成,豆荚图显示所有检查细胞中每个组织的伪空间分数的分位数]


三. 整合 HIO 和原发性十二指肠数据可以追踪人类 ISC 发育过程中的分子转变轨迹

接下来,构建了成人十二指肠的scRNA-seq参考图谱,并整合了tHIO、发育中的和成人的肠上皮细胞亚型,以量化tHIO上皮细胞的成熟度。结果发现发育中的十二指肠和tHIO干细胞-肠上皮细胞的分化轨迹与成人的不同。事实上,研究人员发现每种tHIO细胞类型与发育中的细胞类型更相似。值得注意的是,tHIO和发育中的十二指肠干细胞高度相似,并且在分子上与成人状态不同。另外,还比较了来自成人的肠道小肠类器官转录组,发现这些细胞状态更类似于成人的细胞。这些分析表明,与成人的干细胞相比,tHIO干细胞更类似于发育中的肠道细胞。

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图5. 参考组织和类器官图谱揭示了小肠发育过程中的上皮祖细胞和干细胞状态

 [tHIO、发育中和成人的十二指肠上皮 scRNA-seq 数据集的集成 UMAP,按细胞类型(左)和样品来源(右)着色]


接着,采用scRNA-seq分析了从内胚层诱导成HIO过程中多个不同时间点的样品,以阐明诱导肠干细胞(ISC)命运决定的。鉴于HIO的早期分化事件没有人类参考图谱,于是将体外类器官时间进程与小鼠原肠胚形成图谱进行比较。该分析表明,早期时间点的HIO(第0天球体、c4 和c13)细胞簇表达了定形内胚层(EOMES、SOX17和FOXA2)和原条标记(MIXL1、GSC和LHX1),并且主要定位到前原条。确定了 HIO上皮发育轨迹,以CDX2和CDH1的共表达为标志,主要映射到小鼠肠道上皮。还确定了间充质发育轨迹,其与小鼠间充质/中胚层群体有最高的相似性。另外注意到,虽然cluster9是CDX2+/CDH1+并与肠道上皮和表面外胚层有一定的相似性,但它也表现出中胚层特征(HAND1+/FOXF1+)。还观察到低丰度的神经样(c15和c18)、内皮样(c16)和肠道上皮表面外胚层样(c11)细胞。这些细胞类型的比例在培养14天后下降,4 周时的HIO主要由上皮细胞和间充质细胞群组成。

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  [左:体外HIO发育过程中,采集不同时间点的样品进行scRNA-seq实验的示意图,SPRING按细胞簇着色,由集群划分阴影。右: HIO过程中UMAP按时间点或标记基因表达着色。浅紫色表示肠上皮细胞]


然后,重建了 ISC 成熟路线图。首先,根据体外HIO中CDX2的表达选择肠上皮细胞,映射到发育的多器官参考图谱上。发现体外HIO细胞与tHIO和原代肠组织的干细胞最相似。将这些细胞与来自tHIO和发育中的十二指肠的干细胞结合起来。分别将每个细胞的转录组分解为早期肠祖细胞(第0天球体)和发育中最成熟的ISC(19PCW),并基于ISC成熟度对细胞进行排序。结果观察到类器官和十二指肠发育时间点之间存在对应关系,其中来自受孕后 47、59 和 85 天(即 7、8、12PCW)组织与第14天的HIO和4或8周的tHIO最为相似。综合以上数据将ISC状态从肠上皮祖细胞到成熟ISC的过程分为6个阶段。ISC阶段1-3期(第30天HIO和7PCW发育的十二指肠或更早)是相对原始的阶段。几个重要信号通路的配体、受体和靶基因在这些阶段表现出丰富的表达,例如:Hedgehog信号通路配体IHH和SHH。值得注意的是,ISC标记物LGR5和OLFM4在这些早期阶段并未检测到稳定表达。ISC4-6期(8-19PCW和成人)更加成熟。从8个PCW开始(第4期)LGR5和ASCL2稳定地表达,可被强烈地检测到,而OLFM4表达从12个PCW开始(第5期)开始明显。虽然12-19PCW发育的十二指肠和tHIOs ISC共同表达LGR5和OLFM4,成人ISCs(第6期)由LGR5-低/OLFM4+细胞群占主导。几个成纤维细胞生长因子(FGF)信号传导途径组分在ISC4期和5期之间的表达有显著差异。研究人员确定了在每个ISC阶段中富集的基因以及发育中的和成体干细胞之间的差异表达基因。为了探索ISC成熟调控机制,结合原代十二指肠 ISC 表达数据和TF结合位点预测来推断通常受调控的基因(调节子)。研究人员重点关注在第4-6期丰富表达的调节子,发现JUND和MYC与LGR5+ISCs的获得有关联,而FOSB和NR1H3与OLFM4+ISCs的转变有关联。这些数据表明,整合HIO和原始组织数据可以实现将ISC发育从早期到成熟阶段的时间重建。


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[将体外HIO、发育中的和成体的十二指肠干细胞按ISC状态排序并着色;ISC细胞箱的分层聚类表示使用ISC发育相关基因计算的转录组距离;热图揭示了ISC转变时信号通路的基因表达变化]


四. 整合HIO和原发性十二指肠数据揭示人类肠道间充质发育过程中的瞬时细胞状态

间充质-上皮信号在发育过程中调节隐窝-绒毛结构的出现,并在绒毛形成后维持隐窝稳态。为了研究肠间充质发育,研究人员首先将发育中的人类十二指肠间充质中的细胞簇进行了注释。值得注意的是,ISC状态转换与间充质细胞类型多样化之间存在相关性。另外还注意到,GDF10+(c8)和上皮下间充质(c15)分别表达了重要的干细胞龛因子GREM1 和 NRG1。然后,为了探究间充质细胞簇与初级组织的关系,又整合了tHIO和初级发育中的十二指肠间充质,结果揭示这些类器官和初级间充质之间的转录组存在高度的相似性。接下来,研究人员整合了肠道类器官和发育的十二指肠的数据来表征间充质-上皮干细胞在发育过程中的动力学及其相互作用。

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图S4. 整合HIO和十二指肠数据揭示了人类肠道间充质发育过程中的瞬时细胞状态

[示意图表明,基于转录组相似性和肠上皮干细胞状态协调变化的十二指肠间充质亚型之间的发育关系]


五. NRG1在多能性层面促进体外肠上皮干细胞的成熟

鉴于从LGR5-/ASCL2-到LGR5+/ASCL2+的ISCs转变和上皮下间充质的扩张在8PCW时同时发生,作者假设上皮下间充质和 ISC成熟之间存在关联。NRG1是一种在上皮下间充质中高度表达的配体,据报道是一种重要的干细胞龛因子。为了进一步研究NRG1在肠道发育中的调节作用,比较了在体外HIO培养中添加不同浓度 的NRG1 以及EGF时类器官的发育及其scRNA-seq数据。其中在上皮细胞中,有一个cluster引起了作者的注意,就是LGR5+/ASCL2+细胞群主要来自于采用高浓度NRG1培养的类器官(0E-100N和1E-100N)。

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图6. NRG1促进体外肠上皮干细胞的成熟
[添加EGF、NRG1或两者均不添加的情况下,体外培养HIOs的UMAP]


为了确定每种上皮细胞类型的器官身份,将细胞映射到正在发育的多器官图谱中,并检查了每个器官的个体标记基因的表达模式。观察到在不同培养基中生长的上皮器官特性上的差异。在没有EGF/NRG1(仅NOG RSPO,0E-0N)的情况下,类器官的非增殖性上皮细胞类型大多是肺/食道样(92%),表达SOX2和基底细胞标志物(例如:KRT4和TP63)或纤毛细胞标记物FOXJ1。当NRG1存在条件下,生长的HIO也具有肺/食管样细胞类型(70%,0E-100N; 26%,1E-100N),但在这种条件下更多的细胞类型具有GI转录特征(CDX2+、MUC5AC+或CLDN18+; 22%[0E-100N]和60%[1E-100N]是胃状的; 8%[0E-100N]和14%[1E-100N]是肠状的)。相比之下,与其他条件(29%,100E-0N;36%,100E-1N)相比,在高浓度EGF下生长的HIO具有最高比例的肠上皮细胞类型(CDX2+/CDX1+),并且很少有肺/食管-样细胞类型(9%,100E-0N;7%,100E-1N)。这些结果表明,根据培养条件中是否存在EGF或NRG1,早期模式事件是不同的,EGF是肠道谱系的有效驱动因素。另一方面,尽管在NRG1存在的条件下似乎具有更多的脱靶上皮细胞类型,但此时的肠上皮具有更高比例的LGR5+/ASCL2+细胞,相当于具有更高的上皮细胞成熟度。为了评估成熟度,提取肠上皮细胞数据,并根据与干细胞成熟相关的基因确定“成熟度评分”。用高浓度 NRG1(0E-100N 和 1E-100N)生长的细胞表现出比其他细胞更高的成熟度评分,并且与4周tHIO和8PCW发育的十二指肠相当。在高浓度NRG1培养的ISCs中,ISC标记物LGR5和ASCL2表达明显增加。通过整合ISC调节子、配体-受体配对和KEGG通路注释表明NRG1通过激活ERBB或MAPK信号通路促进 LGR5和ASCL2的表达。然而,EGF和NRG1能够以不同的亲和力与ERBB受体结合。未来还需要解决EGF和NRG1究竟是通过何种分子机制导致了不同的生物学结果。


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[E. 堆积条图(左侧)显示每个HIOs上皮群的器官投射概率和状态比例,点图(中间)显示发育器官的上皮细胞或HIOs簇中器官富集表达的基因,条形图(右侧)显示了单元格编号。F. 豆荚图(顶部)显示在每种条件下生长的HIOs中ISCs成熟度评分的分布,箱型图(底部)显示各个样本中ISC标记分子LGR5、ASCL2和OLFM4的表达水平]


研究者还探讨了NRG1和EGF对间充质细胞状态的影响。观察到肠和肺/食道样间充质簇和基于标记表达的分类簇,注意到由MOXD1(一种食管间充质标记)标记的NKX2-3-depleted簇(c8),在NRG1条件下生长的类器官中被富集出来。作者还发现,与EGF条件相比,在NRG1条件下生长的HIOs中的间充质与十二指肠参考图谱表现出更高的相似性。唯一的例外是由NRG1/DLL1/F3标记的细胞簇(c2),它与在高EGF浓度下生长的HIO中十二指肠上皮下间充质的相似性最高。作者还注意到在EGF条件下生长的HIO具有更高比例的NRG1+上皮下-样间充质。这些数据表明NRG1促进肠上皮细胞和间充质的成熟,但在驱动肠特征获取方面不如EGF有效。



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[示意图显示了NRG1和EGF在肠道细胞命运决定中的前瞻性作用]


接下来,研究者进一步分析了嵌入不同3D基质中的HIOs,以研究细胞外基质(ECM) 对HIOs发育的影响。首先将细胞嵌入藻酸盐基质胶,并添加ENR或仅EGF一起培养,4 周时收集HIOs样本进行scRNA-seq。使用发育的细胞图谱作为参考,结果发现,在同一实验批次中,嵌入藻酸盐及仅EGF的HIO中肠上皮细胞的比例和ISC成熟度与嵌入Matrigel及ENR培养基培养的HIO相当或略好。这些数据支持了先前的工作,证明藻酸盐是用于生成高保真HIOs的Matrigel的可行的ECM替代品。这些数据表明,来自ECM的组合信号塑造了肠上皮干细胞命运的获得和成熟,而HIOs是探索这些机制的强大系统。


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图S6. 体外培养HIOs上皮细胞状态的综合分析
[示意图(顶部)显示了体外培养HIOs的培养条件。豆荚图(底部)显示不同培养条件下肠类器官上皮细胞的ISC成熟度分布]


六. CDX2缺失导致肠细胞命运的丧失以及上皮和间充质中前肠特征的获得

研究者接下来利用HIOs来了解导致人类肠道上皮和间充质细胞类型分化的基因调控机制。使用不同时间进程HIOs的scRNA-seq数据构建了一个TF共表达网络,并确定了区分祖细胞、上皮细胞和间充质细胞的TFs。该分析揭示了差异表达的TF模块,这些模块可能推动早期祖细胞上皮和间充质的多样化。值得注意的是,CDX2(一个肠上皮主要的调节因子,也是中胚层细胞命运分化的调节因子)与早期祖细胞中共表达的基因有一致的定位。CDX2在HIO上皮细胞中高度表达,其在发育中的小肠上皮细胞中的表达一直维持到成年。有趣的是,CDX2也在HIO中的早期间充质祖细胞的一个子集(c5和c9)中以及小鼠原肠胚形成图谱中的中胚层/间充质细胞群中表达。为了进一步探索CDX2对中胚层模式的调节作用,使用HIO的scRNA-seq数据和TF结合位点分别推断间充质和上皮中的调节子。结果发现CDX2被预测可以调节间充质细胞中的一些HOX基因和一些肠道富集的TFs(如HAND1和NKX2-3)。在上皮细胞中,预计CDX2可以调节Hedgehog配体IHH,其相应的受体PTCH1在发育中的间充质中广泛表达。这些结果表明,CDX2可以通过中胚层中的内在调节网络以及通过上皮和间充质之间的Hedgehog信号通路影响肠道间充质细胞的命运。


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图S7. 对照组和CDX2-KO组ESC衍生类器官的细胞组成和差异基因表达分析

[示意图揭示了基于不同时间进程HIOs数据预测的CDX2靶标子集网络]


在人类肠道上皮和间充质命运分化中CDX2是否是必要条件,研究者进行了实验验证。首先获得来自hPSCs的HIOs,这些hPSCs有纯合CDX2敲除株(CDX2 KO)以及相应的对照株,并比较它们的sc转录组。免疫荧光(IF)和scRNA-seq数据也验证了CDX2 KO类器官中CDX2基因表达的缺失。与之前的报道一致,CDX2 KO类器官主要表现出折叠和腺上皮的囊状形态,并且前肠标记物SOX2和MUC5AC呈阳性。将对照与CDX2 KO类器官进行比较揭示了细胞类型组成的差异,CDX2 KO类器官中富含多种上皮细胞群,例如MUC5AC+(c7)、MUC16+(c11) 和SPP1+(c10) 细胞。


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图7. CDX2缺失导致肠细胞命运的丧失以及上皮和间充质中前肠特征的获得

[A. 箱型图(顶部)显示体外HIOs中肠上皮和间实质中CDX2的表达。示意图(底部)揭示CDX2敲除(KO)对HIOs细胞命运的影响。B. 明场(左)视野和免疫荧光(右)成像分别揭示了类器官的形态和上皮标记分子的表达]


CDX2 KO类器官中上皮细胞主要映射到发育中的胃上皮。这些数据表明CDX2 KO肠类器官上皮中肠特征的丢失和胃特征的扩展


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[堆叠条状图(顶部)显示各条件下或簇下上皮细胞预计的器官比例,侧边栏显示了CDX2的表达式。箱型图(底部)显示发育中的肠与胃中差异表达基因在对照及CDX2 KO中的倍数变化]


随后,研究者将对照和CDX2 KO间充质进行了DE分析,并检查了HIO和参考图谱中DE基因的表达模式。在CDX2 KO间充质中具有较高表达的基因在肺亚型中表现出丰富的表达(例如:FOXC1、PRRX1、SOX9和SIX1)。SIX1和PRRX1对于肺形态发生和血管发育是必需的。在肠间充质中广泛表达的TF NKX2-3在CDX2 KO间质中也被观察到表达缺失现象。在发育的内胚层图谱集中的kNN搜索分析也揭示了,与对照相比,CDX2 KO间质更趋向于被映射到发育的肺上。这些数据表明hPSC中的纯合CDX2 KO导致HIOs中肠特性的丧失和肺间充质特征的获得。作者注意到间充质和上皮中预测的CDX2靶基因(包括HAND1,NKX2-3和IHH)在CDX2 KO类器官中均下调。结果表明CDX2对人类肠道发育过程中上皮细胞和间充质细胞命运的获取至关重要,并提供了详细的分析以证明在发育中的人类肠道中控制上皮和间充质命运决定和相互作用的可能机制。


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[F. 对照组和CDX2 KO类器官间充质细胞之间差异表达TFs的特征图。G. UMAP(顶部)显示多器官间充质细胞,堆叠条状图(底部)显示各条件下间充质细胞的投射器官比例。H. 在发育的器官中由CDX2 KO高基因评分为标准进行的间充质UMAP。I. 由对照组和CDX2 KO间充质之间差异表达的TFs为标准进行的间充质UMAP]


本文总结:


目前,对人类肠道间充质发育知之甚少,但了解这种细胞对于了解影响肠道的先天性疾病至关重要。间充质是干细胞龛的重要组成部分,提供结构和生化支持。细胞类型注释、受体-配体配对和细胞亚型特异性基因表达揭示了每个器官和组织中间充质种群的丰富的多样性,其中大部分以前未被探究过。很难分析有些时间点的人体的组织,捕捉人类发展过程中的变化是一个极大的挑战。

本研究的数据和分析为理解人类发育生物学提供了丰富的资源,并为整合复杂的原始组织和类器官数据集创建了一个框架还提供了高度解析的证据,表明人类类器官可以预测人类发育,并且类器官中的扰动可以揭示人类发育的机制。由于类器官中的细胞异质性和脱靶细胞类型的存在,使用类器官模型的sc基因组分析来适当解析相关表型非常重要。本文研究的数据指出了高维人类参考细胞图谱在发育、成年和疾病中的价值,以全面对工程人体组织培养系统进行基准测试,这种比较或许可以用于修改器官协议以改进发育和疾病的建模。

此外,需要来自不同遗传背景、时间点和组织的数据来全面注释人类发育细胞的状态。考虑到类器官的可变性,需要更多来自不同细胞系、批次和协议的类器官,才能更深入地了解HIO技术。根据配体-受体基因对表达推断细胞-细胞相互作用,而无需全面了解组织内的位置。因此,高分辨率空间转录组学或蛋白质组学数据将进一步增强我们对发育器官中配体-受体相互作用的理解。最后,本研究的许多分析都集中在上皮细胞和间充质细胞上,还需要进一步的表征,以了解所有丰富的或罕见的细胞类型及状态相关的发育和谱系动力学。


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